Pesquisa  conduzida  pela  bióloga Maria Clara Duarte Fregolente é responsável por um avanço significativo na caracterização  genética do picobirnavírus (PBV), detectado em amostras fecais de diferentes hospedeiros como cachorros, cavalos,  coelhos,  roedores  e  cobras. O  fato  de  existir  uma  semelhança entre PBV  encontrado  em  animais  e humanos  acende  uma  “luz  amarela” no  que  diz  respeito  a  possíveis  casos de  zoonose  –  doenças  transmissíveis do animal para o homem. A  transmissão  se  dá  por  via  fecal-oral,  portanto trata-se  de  um  vírus  entérico,  que  é eliminado e detectado nas  fezes e que tem penetração pela boca. “Se a pessoa tiver  contato manual  com  as  fezes de animais infectados e não fazer a higiene correta, pode  ter os vírus  introduzidos em seu organismo”, afirmou a bióloga.

Identificado  pela  primeira  vez  em estudos  realizados para  a detecção de rotavírus em fezes de crianças, o PBV é um patógeno que, aparentemente, não possue uma associação com a diarréia. No entanto, em indivíduos imunocompromissados, como pacientes HIV-positivos ou transplantados, essa associação fica mais evidente. “O que parece é que o PBV é um patógeno oportunista, porque se está presente e associado com outros agentes  e/ou  fatores  pode  agravar  o quadro de diarréia. Porém, sozinho, não compromete”, garantiu  a bióloga. Por isso, alertou, o cuidado com a higiene é fundamental, já que os estudos ainda estão em fase inicial e não existem vacinas tampouco medicamentos antivirais específcos. O trabalho resultou na tese de doutorado de Fregolente, orientada pela professora Maria Silvia Viccari Gatti, do Instituto de Biologia (IB) da Unicamp.

A  ligação  da  pesquisadora  com  o PBV  surgiu  ainda  na  graduação,  na iniciação  científica,  quando  também trabalhou  com  cultura de  células para produção de rotavírus e adenovírus. O que era para ser mestrado passou direto para o doutorado e, num primeiro momento, o objetivo  foi  fazer o  sequenciamento  completo  do PBV. Trata-se de  uma  espécie  que  tem  genoma  de RNA  dupla-fita  com  dois  segmentos.

A  pesquisadora  chamou  a  atenção para o fato de que apenas PBV de humanos têm seus segmentos genômicos com  sequenciamento  completo  publicado na literatura. A partir daí – e pelo fato de o  laboratório  ter muitas amostras de animais – surgiu o interesse de fazer o sequenciamento dos segmentos genômicos  e  comparar  as  sequências de nucleotídeos de PBV de humanos e animais. Porém, vários protocolos foram testados e nenhum deles permitiu obter as sequências completas. “Conseguimos sequências menores, de 200 pares de bases de um dos segmentos e a análise foi feita a partir dessa informação”, disse.

Mesmo  não  obtendo  o  sequenciamento completo, a pesquisadora comentou que os resultados obtidos foram não só importantes como também muito interessantes. Ela ressaltou que encontrou uma variação na sequência de nucleotídeos dos PBV muito grande e em alguns animais foi constatado que estavam sendo infectados por dois tipos diferentes de PBV. “São tão diferentes que fca difícil a  comparação  entre  eles”,  reforçou.

Existem, de acordo com Fregolente, poucas  sequências  totais  disponíveis em bancos de dados  sobre PBV. Para ampliar  essa  quantidade  é  necessário ter uma sequência base e, a partir dela, desenhar os  iniciadores. Porém, como se  trata  de  um  vírus RNA,  é  preciso antes  fazer  uma  transcrição  reversa, transformando-o  em DNA. A  bióloga explicou  que  a  partir  das  sequências disponíveis não foi possível estabelecer nenhum  iniciador  capaz  de  funcionar nas  sequências  de  PBV  de  animais.

Isso porque a informação existente nos bancos de dados é de PBV de humanos e pode existir alguma diferença para o PBV de  animal que  impeça o  alinhamento correto do iniciador nas sequências. “Como existe muita diversidade, isso  é possível. As  técnicas que  estão disponíveis na literatura eu não consegui  fazer  funcionar”,  lamentou. Além disso, é bem possível que, pelo fato da amostra  ficar  armazenada  por muito tempo, ocorra  a degradação do RNA.

A bióloga esclareceu ainda que a sequência que todos os pesquisadores conseguem amplificar – e na qual ela baseou seu estudo – é de uma enzima do vírus. O desafo  está  agora  em  sequenciar o outro segmento que codifica as proteínas externas, que formam o capsídeo viral. “Os anticorpos que os animais produzem são exatamente contra essa proteína que fca exposta. Conhecer a sequência da proteína externa será muito importante para obter novas informações”, advertiu.

Contribuição acadêmica
Fregolente considera que foi fundamental apresentar novas sequências de PBV  identificados  em  outros  animais e  até  então  inexistentes  na  literatura. “É  importante  disponibilizar  esses dados  já  que  são  poucos  os  grupos que  trabalham  com  esses  agentes que têm despertado  interesse para  estudos em  outros  continentes,  recentemente” disse. Ela ressaltou ainda que o Comitê  Internacional  de Taxonomia Viral aceitou  a proposição para um  sistema de classifcação para o PBV, enquanto família, gênero e espécie. No entanto, as espécies tipo existentes são apenas PBV de humanos e de coelhos, porque foram os  primeiros  a  serem  sequenciados.

Além  da  classificação  até  o  nível  de  espécie,  os  PBV  também  são classificados  em  genogrupos,  o  que  é considerado  inadequado  pela  pesquisadora. Para se fazer uma classificação correta é importante que se tenha uma maneira de conseguir detectar todos os tipos de PBV por métodos de biologia molecular  e,  a  partir  do  sequenciamento,  poder  separar  as  diferenças e  as  igualdades  visando montar  um sistema de classificação mais efciente.

“Sugerimos também a existência de quasiespécies, que é um fenômeno natural que ocorre em vírus de RNA, especificamente”, disse a bióloga. Trata-se de um momento da evolução dos vírus, no qual eles produzem diferentes mutantes para conseguir se estabelecer. Todas as possíveis mutações são realizadas pelo vírus  até que  ele  encontre  aquela que melhor  se  adapte  ao meio. Fregolente revelou  que  foram  encontradas  essas mutações  de  ponto  em  cada  uma  das
sequências analisadas. “Isso caracteriza variados genomas dentro de uma única população viral”, concluiu.

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Artigos
■  Molecular characterization of picobirnaviruses from new hosts., Fregolente MC, de Castro-Dias E, Martins SS, Spilki FR, Allegretti SM, Gatti MS., Virus Res. 2009 Jul;143(1):134-6.
■  Nomenclature proposal for picobirnavirus., Fregolente MC, Gatti MS., Arch Virol. 2009;154(12):1953-4.
Publicação
Tese de doutorado “Caracterização genética de picobirnavírus detectados em amostras fecais de diferentes hospedeiros”
Autora: Maria Clara Duarte Fregolente
Orientadora: Maria Silvia Viccari Gatti
Unidade: Instituto de Biologia (IB)
Fonte de fnanciamento: Fapesp
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