Uma falha surpreendente, num procedimento comum de análise do DNA de gado nelore, abriu caminho para a descoberta de uma metodologia que pode revelar variações raras no genoma humano, ligadas a diversas doenças. O artigo que descreve o novo procedimento tem, como autor principal, o doutorando do Programa de Genética e Biologia Molecular do Instituto de Biologia (IB) da Unicamp Joaquim Manoel da Silva, e foi publicado no periódico online PLOS ONE.

O orientador de Silva e coautor do artigo na PLOS, pesquisador Michel Eduardo Beleza Yamagishi, do Laboratório Multiusuário de Bioinformática da Embrapa, conta que a descoberta aconteceu depois de um trabalho de genotipagem de nelore, realizado para identificar, numa população de animais, a presença de um tipo de variação genética já reconhecida na literatura – um SNP, ou snip, sigla em inglês para polimorfismo de nucleotídeo único –, apresentar resultado 100% negativo para alguns snips.

“A gente estava trabalhando com uma coleção de cerca de 1.700 animais, bovinos da raça nelore, que é importante para a pecuária nacional”, lembrou o pesquisador. “E o Joaquim chegou para mim e disse: ‘Olha, Michel, tem aqui uns snips que estão falhando em toda a população’. Perguntei: ‘Como é que é?’ E ele: ‘Sim, tem snips que estão falhando em toda a população’. E eu: ‘Não pode ser’”.

Yamagishi lembra que o DNA é formado por uma fita dupla espiralada, composta por sequências complementares de nucleotídeos normalmente denominados pelas letras A,T,G e C. As duas metades da fita se ligam porque  o nucleotídeo A se prende ao T, e o G, ao C. Os chamados chips de genotipagem contêm probes – “sondas”, em inglês – com sequências de nucleotídeos que capturam as sequências complementares, presentes no material sob análise, e anunciam a detecção com um sinal luminoso. No caso da busca por snips, os probes contêm trechos de DNA construídos para detectar e capturar as variações desejadas.

“Com isso, você vai lá direto no snip, sem necessidade de um trabalho dispendioso de leitura do genoma inteiro”, explica Yamagishi. “No nosso caso, esse é um trabalho de bioinformática, uma ciência relativamente nova, e que utiliza essa ferramenta, os chips de genotipagem. Temos o probe com a combinação das letrinhas, e aí o DNA, que tem a complementaridade, vai lá e hibridiza, gruda. E aí emite um sinal de luz. E é esse sinal de luz que depois é lido e transformado no que chamamos de genótipo”.

ÁGUA DO BANHO

“Em alguns casos, por diferentes motivos, há probes que não encontram o alelo complementar, não hibridizam”, descreve o orientador. “Isso pode acontecer por uma série de motivos: erro na preparação da amostra, defeito de fabricação do chip, por exemplo. Então, o que se faz? O que vinha sendo feito até hoje? A gente usa métodos de imputação – ou seja, com a informação que temos das sequências ao redor, inferimos qual seria o genótipo naquela posição. E era esse o trabalho do Joaquim. Ele estava estudando imputação”.

Surpreendente, a falha generalizada na detecção de alguns snips, difícil de explicar como simples erro ou evento fortuito, levou a uma investigação mais profunda. “A gente acreditava que o snip falhava por um problema na preparação do DNA, ou eventualmente um problema na placa... Então, fomos investigar isso, porque é algo muito difícil de acontecer. E descobrimos que os snips perdidos tinham informação relevante. Por quê? Porque estavam falhando de hibridizar justamente porque existia outra alteração na região do probe. Uma variação até então desconhecida, e inesperada, próxima da variação conhecida que estávamos tentando detectar.”

Essa descoberta, alerta Yamagishi, mostra que a prática de descartar os resultados de genótipos perdidos, atribuindo a falha na hibridização dos snips a erros laboratoriais ou do chip, pode estar levando à destruição de informação genética relevante, incluindo a eventual descoberta de novos snips. “Estão jogando a criança fora com a água do banho”, resumiu.

POTENCIAL HUMANO

No artigo publicado na PLOS, Silva, Yamagishi e demais autores propõem formas de pôr esse resultado – o de que “falhas” de genotipagem podem esconder descobertas genéticas relevantes – a serviço da saúde humana.

“Se pegar o título do paper, ele fala em nelore, porque aqui é a Embrapa, certo? Meu aluno é da Unicamp, mas ele está fazendo o trabalho dele na Embrapa, no projeto Genômica Animal II, e a gente tinha dados de gado”, conta o orientador. “Mas este é um paper de metodologia, e se você for olhar lá na discussão, a gente mostra no que esse nosso trabalho pode ser útil para seres humanos”.

O pesquisador lembra que mudanças de um único nucleotídeo na sequência de DNA podem alterar a produção de proteínas nas células humanas, ou o funcionamento de outros genes. Alterações assim podem estar associadas a doenças, e a pesquisa biomédica realiza uma busca constante pela base genética de uma série de problemas de saúde.

“Muitas doenças raras têm causas genéticas”, disse Yamagishi. “São pequenas mutações, um snip que mudou um aminoácido e complicou a vida de alguém. Como essas doenças são raras, há poucos indivíduos afetados, então aí é difícil conseguir recurso para pesquisa, porque do ponto de vista econômico não é atraente”. 

Mas, explica ele, se a busca pela variação genética responsável puder ser feita por meio do processo de genotipagem, utilizando-se chips que leem sequências específicas de DNA, e não pela leitura completa do DNA do paciente, o processo torna-se muito mais rápido e barato. “Pois bem. Se a mutação que causa essa doença rara estiver próxima a um snip que está no chip, essa nossa metodologia se aplica perfeitamente. Então, você, com pouco recurso, consegue identificar a mutação causativa da doença rara”.

“Mas você pode me dizer, ah, legal, mas aí você tem uma restrição muito forte, que é que a mutação ocorra próximo de um snip conhecido”, disse o pesquisador. “Isso é uma limitação muito forte, a gente reconhece no paper. Só que tem um detalhe: no caso de humanos, os chips de genotipagem têm uma densidade muito maior do que em bovino. Bovino tem por volta de 700 mil marcadores. Em humanos, tenho mais de 2 milhões”. 

Yamagishi propõe que chips contendo todas as regiões não-repetitivas do genoma humano poderiam ser usados para detectar os snips raros e desconhecidos. “Se em cada região não-repetitiva do genoma eu colocar um probe lá, pronto: a metodologia é poderosíssima, acaba essa limitação”.

“A importância das regiões serem não-repetitivas é que tem muita repetição no genoma humano, às vezes aparecendo em cromossomos diferentes. Se você constrói um probe em cima dessa região repetitiva, você fica sem saber de onde ela veio”, explicou ele. 

CÂNCER

Outra aplicação possível, derivada da descoberta metodológica apresentada na PLOS, é a detecção das mutações iniciais que aparecem na origem de certos casos de câncer. “Muitos tipos de câncer têm origem em mutações somáticas”, disse ele. Essas mutações ocorrem após o nascimento, e portanto não são herdadas dos pais. 

“Então, imagine uma única célula que sofre uma mutação. A célula vai se dividindo, e todas as células filhas têm essa mutação. Dependendo da gravidade de onde tenha ocorrido essa mutação, pode desencadear o que chamamos de câncer”, explica. “O problema é que, no câncer, pode acontecer uma instabilidade do genoma”, o que leva a um acúmulo de novas mutações, dificultando a tarefa de detectar a alteração original, ou as alterações originais, que realmente causou o desenvolvimento do tumor. 

“As mutações supostamente causativas vão estar em todas as células filhas. O problema é que ocorrem mutações sucessivas, ou subsequentes, e as células filhas de uma que sofreu uma mutação subsequente vai herdar essa mutação, e assim por diante”, descreve Yamagishi. “Isso é ruim para quem estuda câncer, porque há uma infinidade de mutações, posteriores à causativa, e é difícil separar o sinal do ruído”.

“Veja só, agora, quando uma limitação é uma vantagem”, disse ele, referindo-se ao fato de que os probes de DNA dos chips de genotipagem só são capazes de detectar sequências que sejam seus complementos perfeitos. “O probe contém trechos da sequência: A,T,C... Quando ele dá o sinal luminoso? Quando vem um DNA que tem a sequência complementar”. 

“Imagine, agora, que estou com um tipo de câncer e quero tentar descobrir as mutações causativas. Pego lá o tecido cancerígeno, extraio o DNA. Se a mutação causativa ocorreu próximo de um snip do probe, nenhuma das células do tecido, por mais diferentes que sejam, vai fornecer DNA que não tenha essa mutação específica. Então, o resultado do probe vai ser de genótipo perdido, zero, porque não vai ter probe para ligar ali”.

Esse resultado, supostamente “falho”, pode indicar aos pesquisadores o ponto do genoma onde há mais chance de encontrar a mutação causativa, e isolá-la das subsequentes. Assim como no caso das doenças raras, disse Yamagishi, a criação de chips com probes para todo o genoma humano não-repetitivo poderia expandir enormemente a aplicação da técnica.

 “Eu gostaria que as empresas que manufaturam o chip se convencessem a fabricar esse chip que cubra toda a região não-repetitiva do genoma. Aí a aplicação se torna fantástica, imediata. E não é uma coisa difícil de fazer”, declarou ele.