É sabido que o veneno de serpentes é uma mistura complexa de componentes orgânicos e inorgânicos. Duas pesquisas de doutorado, concebidas no Instituto de Biologia (IB) e no Instituto de Química (IQ) da Unicamp, chegaram a algumas revelações sobre proteínas presentes no veneno da jararaca e da cascavel, as quais poderão ter diversas aplicações. Estes estudos, ainda que preliminares, já fornecem um panorama para o entendimento de algumas funções, com a caracterização de proteínas que podem levar inclusive ao desenvolvimento de fármacos.

A pesquisa do IB, por exemplo, encontrou nas proteínas fosfolipases A2 uma possível aplicação de compostos polifenólicos de plantas sobre a ação tóxica do veneno da cascavel. O trabalho apontou que essas fosfolipases, submetidas ao tratamento com compostos naturais derivados de cumarinas, reduziram o seu efeito inflamatório, a agregação plaquetária, a miotoxidade, a citotoxicidade e a neurotoxicidade. Sua autora vislumbra o emprego de compostos polifenólicos sintéticos em ações biológicas para que os efeitos medicamentosos possam ser melhor explorados.

Por outro lado, a pesquisa do IQ chegou à caracterização da proteína BJ8 pela técnica da cristalografia. Esta proteína demonstrou uma capacidade incomum de conduzir à agregação plaquetária, ou seja, à coagulação sanguínea. No estudo, o veneno da cascavel mostrou um efeito neurotóxico e da jararaca hemorrágico, o que permite fazer um prognóstico: uma futura aplicação terapêutica nos problemas de distúrbios neurológicos e de coagulação. Além disso, pela primeira vez observou-se uma molécula de um lisofosfolipídeo presa à proteína, indicando um novo papel como carregador de moléculas.

Ambos os trabalhos se entrelaçam não somente por fazerem abordagem a partir do veneno de serpentes, atuando como pesquisa básica, mas também porque confirmam a necessidade cada vez maior de realizar estudos colaborativos, envolvendo diferentes institutos e diferentes instituições, sem falar no uso de técnicas destacadas como a cristalografia que impulsionam ainda outros estudos.

Um passo que pode colaborar para o desenvolvimento futuro de novos fármacos que tenham ação neurológica e na coagulação sanguínea foi dado pelo químico Marcelo Leite dos Santos. Estudando o veneno de serpentes da fauna brasileira em sua tese de doutorado, defendida no Instituto de Química (IQ) e orientada pelo professor Ricardo Aparicio, o doutorando resolveu a estrutura de importantes proteínas por meio da Cristalografia por Difração de Raios X, uma das técnicas mais difundidas para a caracterização de macromoléculas que permite avaliar a forma da proteína e a organização espacial dos aminoácidos que a compõem. Santos conseguiu, por exemplo, caracterizar a BJVIII, uma proteína que tem potencial para levar à coagulação sanguínea.

Os dois principais resultados da pesquisa foram obtidos a partir da proteína extraída e purificada do veneno da serpente Bothrops jararacussu, popularmente conhecida como jararaca, e da serpente Crotalus durissus cascavella, a cascavel. Caracterizando a proteína BJVIII do veneno da Bothrops jararacussu, Santos deteve-se na sua incomum capacidade de agregação plaquetária (coagulação sanguínea), o que não era esperado para essa classe de proteínas em experimentos de bioquímica.

Entender a estrutura da proteína, expõe Aparicio, ajuda a avaliar as razões que podem explicar o seu funcionamento. O veneno, no caso, não é constituído somente por proteínas. Envolve uma complexa mistura de componentes. A serpente injeta este verdadeiro “coquetel” de constituintes orgânicos e inorgânicos na vítima, causando profundos danos aos tecidos, com iminência de necrose e mesmo de morte. Dentre os principais componentes do veneno estão as enzimas fosfolipases A2 que, em contato com os tecidos do organismo, provocam uma série de reações. Uma delas consiste em induzir coagulação sanguínea na vítima, fato que motivou esta investigação, pois esta atividade biológica não estava de todo esclarecida no caso da BJVIII.

O trabalho foi guiado com a proteína já separada das demais, após ter sido isolada do veneno. Esta purificação da proteína de interesse foi feita graças à colaboração do biólogo Fábio Henrique Ramos Fagundes, aluno de doutorado orientado pelo professor da Unesp Marcos Hikari Toyama, que mantém uma parceria com o Instituto de Biologia (IB) da Unicamp.

Toyama e Fagundes trabalharam tentando entender por que isso acontecia, lançando mão de alguns tipos de técnica. O grupo do IQ dedicou-se à parte da estrutura para chegar aos indícios de “como” isso ocorre. A parte de estudo do veneno das serpentes, diz Fagundes, foi bem fundamentada, sobretudo após observar-se que alguns efeitos poderiam ser usados com fins terapêuticos. Exemplo disso reflete o captopril, um hipotensivo usado comercialmente e que é sintetizado artificialmente com alterações. Antigamente, o captopril era extraído do veneno de serpentes para atuar como fármaco. “Hoje, estudamos as inúmeras proteínas do veneno e seus efeitos, tanto proteínas ligadas à neurotoxicidade quanto aquelas que causam hemorragia e mesmo as que acabam levando à coagulação sanguínea, como é o caso da BJVIII”, expressa Santos.

Efeitos adversos
Os venenos de cascavéis são conhecidos como crotálicos e os de jararacas como botrópicos, e diferem significativamente por provocar reações muito distintas na vítima. Os sinais e sintomas de uma pessoa envenenada por uma cascavel são díspares de outra que foi envenenada pela jararaca. No caso do veneno da cascavel, o efeito principal é neurotóxico, sendo o sintoma mais notório a pálpebra caída. A vítima está exposta ainda ao risco de sofrer uma parada respiratória, visto que o veneno bloqueia o sinal que deveria ir para a parte muscular. Normalmente, a pessoa morre por asfixia, ao serem bloqueados os impulsos nervosos que seguem para os músculos da respiração.

Santos, por outro lado, explica que o veneno da Bothrops jararacussu possui um efeito hemorrágico. Assim sendo, a vítima acaba tendo uma necrose de tecido, destruição do músculo e hemorragia, que às vezes leva à morte. “A vítima pode ainda apresentar perda de membros”, informa Santos. No caso específico deste veneno, existe uma fração proteica que tem um efeito que causa a hemorragia e uma outra fração que causa a coagulação sanguínea. “São efeitos opostos provocados por duas proteínas muito parecidas em sua sequência de aminoácidos.”

Avaliando tais efeitos biológicos, Santos se interessou por desvendar o porquê de uma proteína ocasionar coagulação sanguínea e inferiu que ela poderia apontar para alguma terapêutica relacionada a problemas de coagulação sanguínea. Para ele, esta seria uma visão prática para ancorar melhor a compreensão do mecanismo de funcionamento destas proteínas.

No caso da fosfalipase A2 de cascavel, conforme Santos, foi avaliado o efeito do tratamento químico com um produto natural chamado naringina, um flavonoide amplamente encontrado nos citrus. Com este produto, alterava-se a estrutura dessa proteína e a sua função também, percebendo-se elevada atividade bactericida desta fosfolipase de cascavel. “Era capaz de destruir a membrana celular por quebrar fosfolipídeos de membranas”, constata.

Após o tratamento químico com a naringina, verificou-se que a atividade bactericida foi diminuída e quase inibida por total. Em outras palavras, a mesma proteína, depois de tratada, não mais destruía a membrana da bactéria. “Empregamos uma técnica complementar, chamada Espalhamento de Raios X a Baixos Ângulos (SAXS), para avaliar as modificações na proteína”, conta o químico.

Aparicio esclarece que entender tais processos pode, mesmo que não de imediato, colaborar para o desenvolvimento de novos fármacos. “Marcelo obteve resultados importantes que adicionam mais uma peça num intrincado quebra-cabeça. As estruturas obtidas permitiram formular novas hipóteses sobre o mecanismo pelo qual a fosfolipase de jararaca, BJVIII, exibia um inesperado efeito de agregação plaquetária.”

O propósito de estudar as duas proteínas, complementa Fagundes, emergiu do efeito de agregação plaquetária. Além disso, proteínas de serpente vêm sendo estudadas para bloqueio de sinais sobre os quais não se tem controle, em distúrbios neurológicos nos quais há passagem de um sinal muito amplificado. “Desta forma, os mecanismos de ação destas fosfolipases poderiam ser úteis na busca de algum mecanismo de bloqueio de transmissão nervosa indesejada nos sistemas biológicos.”

Carregadoras moleculares
De acordo com Santos, no caso da fosfolipase de jararaca, a BJVIII, verificou-se que existia uma molécula chamada ácido lisofosfatídico ancorada no sítio ativo, uma região importante da proteína. O curioso nesta descoberta foi que pela primeira vez notou-se uma molécula de um lisofosfolipídeo presa a uma proteína deste tipo. Isso sugere que o achado está ligado a um novo papel de ação dessa proteína, que atua como carregadora de moléculas que podem sinalizar para um efeito farmacológico.

Atribuiu-se, a partir desse estudo, o efeito de coagulação sanguínea e o efeito de agregação plaquetária não à proteína BJVIII, como se pensava antes, e sim à molécula que estava presa dentro da proteína para ser liberada somente no momento adequado, onde esta molécula iria atuar nas plaquetas induzindo a agregação plaquetária e iniciando a cascata da coagulação.

A função de uma proteína, por exemplo uma enzima, está diretamente relacionada ao modo como seus átomos se organizam em três dimensões. As proteínas são moléculas muito grandes – centenas ou milhares de átomos – formadas por pequenas unidades, chamadas aminoácidos, que se encaixam um após o outro numa sequência determinada por DNA, permanecendo unidos como se fosse um “fio”. Com os 20 aminoácidos comumente encontrados na natureza, os organismos vivos são capazes de gerar um número enorme de combinações.

Esse “fio” de aminoácidos se retorce de modo a gerar a estrutura tridimensional da proteína, na qual aminoácidos, inicialmente distantes na sequência, podem acabar ficando muito próximos quando vistos em três dimensões. Normalmente, dentre centenas de aminoácidos, apenas alguns poucos são responsáveis pela ação da proteína e, por isso, conhecer sua estrutura com precisão é essencial para entender seu funcionamento.

Quando os estudos de Santos foram iniciados, já existiam estudos farmacológicos utilizando várias técnicas que mostravam que esta determinada proteína que se classifica como a fosfolipase era capaz de atuar induzindo a agregação plaquetária. Acreditava-se que, em geral, a própria proteína teria potencial para fazer uma reação química e provocar mudanças que levariam a este efeito de agregação.

Em particular, Santos observou que não era bem assim. “O que a gente consegue observar, olhando a estrutura da molécula e da proteína, como um todo, é que há uma outra molécula pequenininha sempre ligada a esta proteína. Uma das novidades do trabalho está nessa nova hipótese de que a fosfolipase tem condições de atuar como um transportador de outras moléculas pequenas.” No caso da serpente, quando ela produz o veneno, também produz essa pequena molécula (muito pouco solúvel em água) que entra dentro da proteína. “A proteína do veneno transporta esta molécula que, uma vez liberada, é capaz de induzir a agregação plaquetária, relacionada à coagulação sanguínea, formação de coágulos na circulação e morte da vítima por embolia”, assinala Aparicio.

O complexo proteico
A Cristalografia por Difração de Raios X é hoje a principal técnica de escolha para determinar a estrutura das proteínas. Nela, as moléculas de proteínas são forçadas a se encaixarem de um modo muito bem ordenado – um cristal. Expondo os cristais aos raios X, consegue-se obter com precisão a posição dos átomos, revelando a estrutura proteica. Pode-se cristalizar a proteína sozinha ou junto com moléculas menores, que interagem com ela formando um “complexo proteico”. A Unicamp, através do Laboratório de Biologia Estrutural e Cristalografia (Labec) do IQ, implantado por Aparício e colaboradores em 2004, está entre as poucas instituições do país a oferecer infraestrutura e as capacidades necessárias para determinar estruturas de proteínas.

Além de sua importância em pesquisa básica, a cristalografia é essencial ao desenvolvimento de drogas. Elas geralmente são moléculas pequenas projetadas para se “encaixar” nas proteínas, interferindo em sua ação dentro da célula viva. Havendo um composto inicial, candidato à droga, e usando como guia estruturas de complexos proteicos, os átomos da molécula pequena podem ser modificados para aumentar sua atividade sobre a proteína de interesse.

A cristalografia pode ainda ser utilizada na determinação da estrutura das próprias moléculas pequenas sem a presença de proteínas, informação muito importante durante o estabelecimento de rotas para a síntese orgânica de compostos com atividade biológica.

Nessa direção, um importante adicional ao parque instrumental do IQ está em fase de aquisição com recursos do projeto temático da Fapesp “Biologia química: novos alvos moleculares naturais e sintéticos contra o câncer. Estudos estruturais, avaliação biológica e modo de ação”, coordenado pelo professor do IQ Ronaldo Aloise Pilli. O projeto deve desenvolver compostos com atividade contra o câncer. O novo equipamento, um difratômetro para monocristais de última geração, auxiliará na determinação da estrutura de pequenas moléculas e nos estudos de sua interação com proteínas. (Isabel Gardenal)

Compostos reduzem inflamações
e coagulação sanguínea

A veterinária Fabiana Vieira Fonseca, doutora pelo Instituto de Biologia (IB) da Unicamp, encontrou em um grupo de enzimas denominadas fosfolipases A2 (FLA2) uma fonte de inspiração especial para a possível aplicação de compostos polifenólicos de plantas sobre a ação tóxica de determinados venenos de serpentes, no caso a Crotalus durissus, a cascavel. A pesquisadora, que foi orientada em sua tese de doutorado pelo professor Marcos Hikari Toyama, da Unesp Campus Experimental do Litoral Paulista, apontou que essas fosfolipases, ao serem submetidas ao tratamento com determinados compostos polifenólicos (componentes naturais extraídos de uma variedade de plantas), no caso derivados de cumarinas, reduziram o seu efeito inflamatório, a agregação plaquetária (coagulação sanguínea), a miotoxidade (que produz lesões de fibras musculares esqueléticas), a citotoxicidade (morte celular induzida) e a neurotoxicidade (produção de um efeito venenoso ou letal sobre o tecido nervoso).

A pesquisadora e o seu orientador vislumbram nestes achados a possibilidade de empregar compostos polifenólicos sintéticos em ações biológicas para que seus efeitos medicamentosos possam ser melhor explorados em nível enzimático e molecular. Toyama explica que as fosfolipases A2, além de seu poder enzimático atuando na digestão de lipídios, possuem uma importante função de controle de determinadas atividades celulares. No caso das FLA2 isoladas de veneno de serpentes, estas proteínas podem desencadear processos patológicos significativos.

O estudo de Fonseca foi feito com amostras de FLA2 isolada do veneno de Crotalus durissus rurima e da Crotalus durissus cumanensis, provenientes do norte do país. Segundo a pesquisadora, são exemplares que vivem no Amazonas e em região próxima à Venezuela. A escolha recaiu sobre estas serpentes pelo fato de terem sido ainda pouco investigadas, inversamente aos estudos com o veneno da Crotalus durissus terrificus, outra subespécie que já foi alvo de muita atenção. O objetivo era avaliar a capacidade dos compostos polifenólicos em inibir a ação tóxica de enzimas fosfolipases A2 presentes nos venenos.

Fonseca diz que muitas das atividades farmacológicas do veneno podem estar direta ou indiretamente ligadas à atuação enzimática da molécula ainda que, em estudos comparativos da estrutura dessas FLA2, todas tenham a mesma plataforma molecular. Estudando agregação plaquetária em particular, a pesquisadora verificou que o tratamento com os compostos polifenólicos reduziu fortemente a agregação induzida pela FLA2 não tratada. Para Toyama, a gênese está, provavelmente, na modificação de alguns aminoácidos, que podem induzir mudanças estruturais e funcionais da FLA2.

Grupo de pesquisa
A investigação de Fonseca integra um grupo de pesquisa formado por especialistas da Unesp, Universidade Presbiteriana Mackenzie e Universidade Federal de São Paulo, coordenado por Toyama, que está desenvolvendo vários trabalhos que tiveram como ponto de partida o estudo de alguns compostos isolados da natureza. A veterinária, no caso, optou por compostos sintéticos e por isso sua pesquisa envolveu prospecção, análise da ação antiveneno e a possibilidade de síntese, retirando da natureza os compostos polifenólicos para isolá-los com o intuito de utilizá-los, abrindo espaço para os compostos sintéticos em laboratório.

Neste grupo, relata Toyama, são abordados os efeitos de alguns componentes naturais encontrados em plantas, que são os polifenólicos. Estes compostos têm uma função muito importante no organismo – proporcionar algumas qualidades diferenciadas às plantas. Podem, inclusive, auxiliar na polinização ajudando na disseminação das sementes, na inter-relação de plantas (alopatia) e na defesa.

Eventualmente, descreve o coordenador, os seres humanos podem ter acesso a estes componentes por meio da dieta alimentar, através da ingestão de sementes, de frutas e de folhas. “Então esta ingestão fará a incorporação desses compostos polifenólicos na nossa dieta, o que pode representar um ganho de qualidade”, comenta. Como podemos medir esta melhoria? Estes compostos são capazes de trabalhar celularmente de forma a aumentar as defesas antioxidantes do organismo. “Temos um conjunto de enzimas para gerar energia e outros compostos, como os radicais livres”, contextualiza. Estes radicais livres em altas concentrações, esclarece, podem induzir uma alteração fisiológica e estrutural das células. “Em algumas situações, a produção desses compostos suplementa a ação das enzimas antioxidantes, que tem a função de neutralizar os radicais livres, os quais podem, às vezes, resultar em danos e morte celular.”

Segundo Toyama, estudos recentes sugerem que os compostos polifenólicos também têm uma ação como fitoestrógenos, fortes aliados nas terapias de reposição hormonal, promovendo o melhoramento de algumas enzimas e de algumas proteínas. “Então basicamente partimos de uma questão dentre os antioxidantes, a Medicina Ortomolecular, para uma questão de Nutricêutica e Cosmocêutica – compostos que são coadjuvantes no melhoramento celular e no trabalho de função do organismo”, afirma.

O grupo de pesquisa tentará agora entender a ação dos compostos polifenólicos como anti-inflamatório, categoria de fármacos que tem em comum a capacidade de controlar a inflamação e a dor. Havendo um processo inflamatório (que se trata de algo natural em resposta a algum patógeno ou injúria celular) no qual será ativado um conjunto de enzimas, enfatiza Toyama, uma delas a ser prontamente cogitada será a fosfolipase A2. É que ela gera um composto oriundo de sua ação sobre os fosfolipídios de membranas que produzirá o ácido aracdônico (mediador químico). “Este ácido, por sua vez, seguirá a chamada cascata da inflamação”, ressalta.

Mas para avançarem os achados sobre esses compostos, o ponto chave encontrado pelo grupo será decifrar o seguinte: “já que os polifenoides são capazes de atuar nessas enzimas fosfolipases A2 e podem inibir ou atenuar o efeito da inflamação indesejada, então qual seria o efeito desses compostos sobre a atividade de algumas outras enzimas presentes em outros organismos?”.

Toyama realça que as fosfolipases A2 fazem parte da fisiologia e que atuam na degradação dos fosfolipídios da dieta. Esta é a sua função fisiológica, salienta. Ocorre que, em outros organismos como serpentes ou dos insetos, estas mesmas enzimas podem ter uma atuação como toxinas. Além dessa atividade enzimática, têm seu potencial farmacológico. “Este estudo tenta abordar os efeitos desses compostos antioxidantes sobre a ação dessas enzimas que são encontradas em outros animais, inclusive peçonhentos, como a abelha, a qual pode induzir ao edema de glote”, refere. No entanto, antes de chegar à aplicação desses achados, muitas outras pesquisas deverão ser feitas a fim de conhecer todos os aspectos que envolvem a FLA2.

Outro trabalho do grupo está relacionado a compostos isolados de plantas. A ideia é formar expertise em algumas nuances que não se consegue compreender sozinho, posto que o assunto é muito complicado”, relata o coordenador. A pesquisa de Fonseca, graduada pela Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), contou com o apoio da farmacêutica Verônica Soares Gomes, que estudou a estrutura e a função dos compostos polifenólicos, e da bióloga Camila Cotrim, que estudou a biologia estrutural desses compostos, ambas graduadas pela Unesp-Araraquara.

Antiagregante
Gomes, que integra o grupo de Toyama desde 2007, destaca a atividade antiagregante. No mercado, informa, existe hoje somente um tipo de antiagregante: que é o ácido acetilsalicílico, o AAS; e um anticoagulante, a heparina, ou varfarina. “Com a pesquisa da Fonseca, notou-se que estes compostos poderão ser transformados em medicamento antiagregante plaquetário e comercializados por indústrias interessadas nesta ação.” O trabalho de doutorado de Gomes abordará a atividade de uma planta, a Tithonia diversifolia, que emprega seus extratos contra o veneno total e a fração de FLA2 da Bothrops e da Crotalus.

Descoberta a atividade de inibir a FLA2 e havendo interesse de desenvolver um novo medicamento, os próximos passos serão estabelecer se o produto será uma pomada ou um injetável e realizar estudos toxicológicos. “O mais importante foi retirar da própria natureza essas possibilidades”, conta Toyama.

Um dos pontos fortes do grupo, realça ele, é tentar aliar novos conhecimentos a essa linha. Cotrim, por exemplo, está envolvida numa parceria com a Universidade Federal do Ceará (UFC) para descrever a ação molecular do composto polifenólico sobre a FLA2. Nesta fase ocorre o teste de docking, uma técnica que obtém a molécula da FLA2. Busca-se inserir no contexto espacial como seria a ação deste composto através do cálculo de energia, inversão de energia e interação de interfaces, chegando à inserção do composto polifenólico na FLA2.

O docking, conforme Cotrim, foi fundamental porque já haviam especulações de como esta molécula iria se ligar à proteína. A pesquisa mostrou onde ocorrem as prováveis interações e quais os tipos de interação. A partir daí, especulou-se como isso modificaria as atividades. A priori, com o emprego dos flavonoides (antioxidantes de origem vegetal), notou-se uma diminuição em determinadas atividades farmacológicas. “Este estudo ajuda a entender porque isso está acontecendo estruturalmente e porque ela se ligou justamente nesta região. Saber como os sítios da enzima são relevantes e quais são, o tipo de flavonoide, o tipo de ligação e como ela influirá na diminuição ou não de alguma atividade farmacológica são de inestimável valor.”

Toyama defende que, do ponto de vista acadêmico, esses trabalhos devem apontar para o potencial de modificação de algumas proteínas; desvendar o mecanismo de ação anti-inflamatória desses compostos, já que existe uma forma de mecanização deles; e ampliar o conhecimento. “Começamos com uma proposta modesta de fazer alguns exames enzimáticos e farmacológicos, porém faltavam vários pontos a serem esclarecidos, como esta mecânica de ação dos compostos polifenólicos”, afirma. Outras etapas devem levar às modelagens químicas e moleculares, aliadas às observações experimentais.

Como último ponto, Toyama esclarece que estes estudos caminham na direção de permitir a síntese mais apurada de alguns compostos naturais já determinados. Assim, no lugar de sintetizar uma série de compostos, seriam sintetizados apenas alguns, economizando no processo de descoberta de novas moléculas ativas.”